塑料作为一种广泛应用于生活中的材料，其优异的性能特点如重量轻、加工性好、耐用性强以及低成本等,使其成为不可或缺的日用品。然而,传统的石油基塑料由于难以降解,在大量使用和废弃的过程中，造成了严重的环境污染问题,引发了人们的广泛关注。因此，生物工程师们一直在努力开发可替代石油基塑料的生物降解性塑料。

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其中，聚羟基烷酸酯(PHAs)作为一种可生物降解的聚合物，受到了广泛关注和研究。PHAs是由多种微生物合成并在细胞内积累的聚合物，可作为碳、能量和还原力的储存材料。与传统的石油基塑料相比,PHAs具有良好的生物降解性,在环境中能够被微生物分解,不会对生态环境造成长期污染。然而,天然产生的PHAs并不能完全满足当代塑料市场的性能需求,如机械强度、热稳定性等方面存在一定的局限性。为此,人们致力于通过修改PHAs的单体组成或引入新型单体来丰富其性能特点,使其能够更好地替代传统塑料。

引入芳香族侧链单体是一个颇有前景的研究方向，芳香族侧链相芳烃可以提高PHAs的热稳定性,从而实现更广泛的应用。这些含有芳香族重复单元的PHAs,有望取代传统的不可生物降解的石油基芳香族塑料,如聚苯乙烯（PS）和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等。然而,目前对芳香族PHAs的研究与脂肪族PHAs相比仍处于相对初级阶段,主要存在以下两个方面的挑战:

一、缺乏关于产生芳香族羟基辅酶A的代谢途径的知识。芳香族羟基辅酶A是PHAs聚合的必要中间体,但目前对其代谢机制的了解还比较有限。

二、能够聚合芳香单体的PHA合成酶在自然界中比它们的脂肪类合成酶要少得多。这使得芳香族PHAs的生产主要依赖于向培养基中添加相应的芳香族前体,而这些前体通常是有毒且昂贵的。

在这项研究中,研究人员通过以下三种策略对大肠杆菌进行代谢工程改造,以生产聚(PhLA)并显著提高聚(3HB-co-PhLA)的产量。

首先，在一株大肠杆菌菌株中建立了一条由葡萄糖合成聚(PhLA)的代谢途径。同时,通过引入来自天然生产PHA的生物体的PHA颗粒结合蛋白,提高了这种芳香族聚酯的积累。

其次，对大肠杆菌的中心碳代谢和山梨酸途径进行代谢工程改造,以增加向PhLA的代谢通量。通过进一步的基因修饰,基于多次批次发酵的结果,开发出一株最优化的大肠杆菌菌株。

最后，通过对关键的聚合酶PHA合酶PhaC1437进行工程改造,以提高聚(PhLA)的合成。

一、PhLA代谢途径的构建

聚苯乳酸(poly(PhLA))的生产最初是基于大肠杆菌(E. coli)XB201TBAF菌株实现的。该菌株通过两个质粒建立了poly(PhLA)生产的代谢途径:一个质粒用于增强向苯乳酸(PhLA)的代谢通量,另一个质粒用于建立PhLA聚合的代谢途径。这种改造菌株被命名为TBAFp,成功生产了poly(PhLA),但积累量较低(2.56 ± 0.69 wt%)。

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为了提高聚合物产量,他们引入了来自天然PHA生产菌的PHA颗粒结合蛋白(phasins)。phasins在PHA的形成、分裂和稳定化过程中起关键作用。选择了三种代表性PHA生产菌株的phasins进行评估:C. necator的PhaP1、P. putida和P. oleovorans的PhaI。结果显示,表达P. oleovorans phaI和P. putida phaI的菌株,其聚(PhLA)的滴度和含量均有所增加。

为进一步提高聚合物积累,他们调节了phasins基因的表达。在C. necator中,PhaR可以结合到phaP1的上游区域调控其表达;在P. putida和P. oleovorans中,PhaF具有DNA结合域和PHA颗粒结合域。他们分别表达了phaR、phaP1和phaR、phaIF操纵子,发现共表达这些基因的菌株聚合物产量和含量明显提高。尤其是表达P. putida PhaIF操纵子的菌株,生产了0.28 ± 0.02 g/l的聚(PhLA),PHA含量为19.59 ± 1.22 wt%。

他们还尝试使用合成Anderson启动子来表达表壳蛋白基因,但未观察到聚合物积累的显著增加。目前,通过额外表达phaR或phaF进行基因调控是提高聚(PhLA)积累的最有效方法。因此,选择携带P. putida PhaIF操纵子的TBAFp菌株(命名为TBAFpp)进行进一步研究。在TBAFpp菌株的补料分批发酵中,产生了0.8 ± 0.0 g/l的聚(PhLA),PHA含量为11.2 wt%。

因此，通过引入phasins基因并对其表达进行调控,成功地提高了大肠杆菌生产聚苯乳酸的能力。这为未来进一步优化和工业化生产聚苯乳酸奠定了基础。

二、优化PhLA代谢通量

首先,研究人员构建了一种不需要氨基酸补充即可生长的TLF菌株,并通过调控aspC和tyrB基因的表达来提高PhLA的产量。TLF17B菌株经过优化后,在无需氨基酸补充的情况下,PhLA产量达到了0.63 g/L,超过了需要氨基酸补充的原始菌株。

进一步,研究人员构建了TLF17Bpp菌株,能够生产含有20.31 wt%聚苯乳酸的聚羟基脂肪酸(PHA)。在发酵过程中,该菌株的聚苯乳酸产量达到了2.0 g/L,明显高于需要氨基酸补充的原始菌株。

为了实现无诱导剂生产,研究人员构建了TLF17BP菌株,通过整合pheA^fbr基因到基因组中,实现了对聚苯乳酸生物合成通路的代谢调控。该菌株在无需IPTG和氨基酸补充的条件下,聚苯乳酸产量达到了2.3 g/L,PHA含量为13.6 wt%。

最后,通过增强PEP合酶的表达和敲除pykF基因,进一步提高了碳通量向shikimate通路的流向,构建了TLF17BPApp菌株。该菌株在发酵条件下,聚苯乳酸产量达到了2.7 g/L,PHA含量为24.32 wt%,显著优于前述菌株。

三、PHA合成酶工程

为进一步提高聚合物的生产,研究人员对PHA合成酶(PhaC)进行了工程改造,以增强其聚合能力。之前的研究主要集中在修改PhaC以生产具有特定单体组成的PHA,包括poly(3-羟基丁酸-co-中链3-羟基烷酸)、PLA和poly(3-羟基丁酸-co-乳酸)。由于用于生产poly(PhLA)的PhaC1437的3D结构尚未知,研究人员采用了基于预测3D结构的理性突变方法,成功地进化了PhaC1437,使其更适合于PhLA的聚合。

具体来说,研究人员首先利用同源建模方法预测了PhaC1437的3D结构,然后通过分子动力学模拟和对接模拟,识别出20个潜在的有益突变位点。将这些突变体在体内进行测试后,发现PhaC1437(T259G)、PhaC1437(M495E)和PhaC1437(N469Q)三个突变体在poly(PhLA)的积累方面优于原始PhaC1437。进一步的分析表明,这些突变位点都位于活性位点附近,但并未直接位于PhLA-CoA的结合界面。这些突变可能通过改善酶的热稳定性或扩大底物结合口袋来提高催化效率。

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为进一步提高poly(PhLA)的生产,研究人员进行了突变组合,发现PhaC1437(T259G/M495E)双突变体在流加培养发酵中可以产生最高32.05±1.47 wt%的poly(PhLA)。此外,通过优化供料策略和代谢工程,研究人员还进一步提高了PhLA和poly(PhLA)的生产水平,最高分别达到11.0 g/L和12.3±0.1 g/L,这是目前最高的报道水平。

四、提高聚(3HB-co-PhLA)的产量

为探索是否可以同样提高poly(3HB-co-PhLA)的生产水平,研究人员构建了3HB单元聚合的代谢通路,引入了C. necator的PhaA和PhaB两种异源酶,可以将两分子乙酰辅酶A转化为3HB-CoA。之前的研究表明,3HB-CoA可以与PhLA-CoA被PhaC1437共聚合成poly(3HB-co-PhLA)。

鉴于PhaC1437(T259G/M495E)是PhaC1437的改造突变体,研究人员预期它也能够共聚3HB-CoA和PhLA-CoA。因此,他们构建了TLF17BPAppTMAB菌株,在TLF17BPAppTM菌株的基础上,额外表达了phaA和phaB基因。在流加培养发酵中,该菌株可以生产49.7±1.0 g/L的poly(3HB-co-13.7 mol% PhLA)和55.2±1.6 g/L的poly(3HB-co-19.7 mol% PhLA)。

进一步地,研究人员将之前最优的poly(PhLA)生产菌株TLF17BPALppTM,也改造成了能够生产poly(3HB-co-PhLA)的TLF17BPALppTMAB菌株。在流加培养发酵中,该菌株可以生产61.4±0.0 g/L的poly(3HB-co-11.7 mol% PhLA),这是目前报道的最高芳香聚酯产量。在30 L发酵罐中的放大试验也验证了该结果,可以生产40.5±1.1 g/L的poly(3HB-co-16.7 mol% PhLA)。

对所得到的聚合物进行了表征,发现其分子量分布、玻璃化转变温度和杨氏模量等性能指标,与商业聚合物如PBT相当,显示了良好的材料特性。

这项研究成功实现了大肠杆菌对不相关碳源的芳香聚酯的代谢工程生产,包括同源芳香族聚酯和芳香共聚酯,克服了之前芳香聚酯生产受限于单体供应不足、聚合效率低、以及在非天然PHA生产菌中积累困难等问题。通过引入天然PHA生产菌的phasin蛋白、基因组工程重定向碳通量、理性改造PhaC酶等措施,大幅提高了芳香聚酯的生产水平,实现了目前最高的产量记录。所生产的生物降解芳香聚合物具有广泛应用前景,可替代传统芳香聚合物,并应用于生物医用领域,其中最高产量的poly(3HB-co-PhLA)有望替代PBT等常用塑料,而非晶态低分子量的poly(PhLA)则适合用于药物递送系统;基于本研究建立的代谢工程菌株,还可进一步开发包含PhLA在内的各种新型芳香共聚酯,满足不同应用需求,具有广阔的应用前景,这项研究在芳香聚酯的生物合成和应用方面取得了重要突破,为生物基可降解塑料的实际应用奠定了基础。